細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

非整倍體無限細(xì)胞系和癌細(xì)胞株中，仍然存在不同細(xì)胞亞群，它們的功能和生長特點(diǎn)有些差異，其中有些亞群細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境有較大的適應(yīng)性和具有較強(qiáng)的獨(dú)立生存能力，細(xì)胞集落率高。純化細(xì)胞群來自一個(gè)共同的祖細(xì)胞，細(xì)胞遺傳性狀、生物學(xué)特性相似，利于實(shí)驗(yàn)研究。原代培養(yǎng)細(xì)胞和二倍體有限細(xì)胞系，細(xì)胞集落率很低。細(xì)胞集落化培養(yǎng)之前，應(yīng)先測定細(xì)胞集落形成率，以了解細(xì)胞在極低密度條件下的生長能力。

目前認(rèn)為僅有腫瘤干細(xì)胞具有形成集落的能力，集落抑制率常用于抗癌藥物敏感試驗(yàn)、腫瘤放射生物學(xué)試驗(yàn)。

集落抑制率=（1-（實(shí)驗(yàn)組集落形成率/對照組集落形成率））×100%

（一）原理

細(xì)胞集落形成率 單個(gè)細(xì)胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細(xì)胞群體，稱為集落或克隆。每個(gè)克隆含有50個(gè)以上的細(xì)胞，大小在0.3-1.0mm 之間。集落形成率表示細(xì)胞獨(dú)立生存能力。常用方法有平板集落形成試驗(yàn)、軟瓊脂集落形成試驗(yàn)。

（二）實(shí)驗(yàn)用品

1.材料：Hela細(xì)胞。

2.器材：（直徑 60mm ）培養(yǎng)皿、細(xì)胞記數(shù)板、燒杯、吸管、離心機(jī)、離心管、廢液瓶、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、水浴鍋。

3.試劑：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清細(xì)胞培養(yǎng)液、安爾碘、瓊脂。

（三）方法

1.平板克隆形成試驗(yàn)

本法適用于貼壁生長的細(xì)胞，包括培養(yǎng)的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。

（1）對指數(shù)生長期細(xì)胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液。

（2）細(xì)胞懸液反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分分散，單個(gè)細(xì)胞百分率應(yīng)在95%以上。細(xì)胞記數(shù)，并用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，待用。

（3）根據(jù)細(xì)胞增殖能力，將細(xì)胞懸液倍比稀釋。一般按照每皿含50、100、200個(gè)細(xì)胞的濃度分別接種5ml細(xì)胞懸液到培養(yǎng)皿（直徑 60mm ）中，以十字方向輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。

（4）培養(yǎng)皿置 37℃ 、5%CO2中培養(yǎng)2~3周，中間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液。

（5）當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心浸洗2次，空氣干燥。甲醇固定15分鐘，棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10分鐘，流水緩慢洗去染液，空氣干燥。

2.軟瓊脂集落形成試驗(yàn)

本法適用于非錨著依賴性生長的細(xì)胞，如骨髓造血干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞株、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。利用瓊脂液無粘著性又可凝固的特性，將腫瘤細(xì)胞混入瓊脂液中，瓊脂液凝固使腫瘤細(xì)胞置于一定位置，瓊脂中腫瘤細(xì)胞可能向周圍作全方位的移動(dòng)，因此可以用來檢測腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)移動(dòng)能力。腫瘤細(xì)胞在適宜培養(yǎng)基中又可以增殖，從而可以測定腫瘤細(xì)胞克隆形成率。造血系統(tǒng)軟瓊脂集落形成試驗(yàn)方法相同，主要用于有關(guān)細(xì)胞分化的研究，但使用培養(yǎng)基不同。

（1）同上（1）~（3）步驟。

（2）調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×103個(gè)/ml細(xì)胞。

（3）制備底層瓊脂，完全溶化的5%瓊脂和 37℃ 左右預(yù)溫的新鮮完全培養(yǎng)液以1：9比例在 40℃ 均勻混合，加入培養(yǎng)皿（直徑 60mm ）中，每皿含0.5%瓊脂培養(yǎng)基2ml，室溫下瓊脂完全凝固。

（4）制備上層瓊脂,取 37℃ 不同密度梯度（按照每皿含50、100、200個(gè)）的細(xì)胞懸液1.5ml移入小燒杯中，加入 40℃ 、5%瓊脂等體積混勻，即成0.25%半固體瓊脂培養(yǎng)基。配好的半固體瓊脂培養(yǎng)基立即加入鋪有底層瓊脂的培養(yǎng)皿中，室溫下瓊脂凝固。 37℃ 、5%CO2靜置培養(yǎng)2-3周。

（四）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.定期觀察細(xì)胞培養(yǎng)過程中集落的形成。

2.顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞克隆數(shù)，然后按下式計(jì)算集落形成率：

集落形成率（%）=（集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100

（五）注意事項(xiàng)

1.瓊脂對熱和酸不穩(wěn)定，如果反復(fù)加熱，容易降解，產(chǎn)生毒性，同時(shí)瓊脂硬度下降。故瓊脂高壓滅菌（ 10磅 15分鐘）后按一次用量進(jìn)行分裝。

2.細(xì)胞懸液中，細(xì)胞分散度>95%。

3.軟瓊脂培養(yǎng)時(shí)，注意瓊脂與細(xì)胞混合時(shí)溫度不要超過 40℃ ，以免燙傷細(xì)胞。

4.接種細(xì)胞密度不宜過高。

5.細(xì)胞在低密度條件下培養(yǎng)，生存率明顯下降，無限細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞株克隆形成率一般在10%以上。但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限細(xì)胞系僅為0.5~5%,甚至為零。為提高集落形成率，必要時(shí)在培養(yǎng)基中添加胰島素、地塞米松等促細(xì)胞克隆形成物質(zhì)。

（六）復(fù)習(xí)思考題

比較平板克隆形成試驗(yàn)和軟瓊脂集落形成試驗(yàn)的異同。

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